一文读懂生物制品安全性之支原体污染检测

　　支原体(Mycoplasma)属于柔膜体纲，是介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁的原核细胞微生物，他们是已知*小的自我复制的原核生物。支原体细胞大小和形态存在差异，大小介于细菌和病毒之间，能够透过一般滤膜（0.22μm），呈高度多形性，有球形、杆状、丝状、分枝状等多种不能被革兰氏染色，但可在琼脂固体平板上形成“菌落”且可被甲基蓝染色。支原体以寄生和共生方式存活，部分可能导致动物、植物宿主的病变。对人致病的支原体主要有肺炎支原体、溶脲脲原体、人型支原体、生殖器支原体等。支原体是细胞污染物中比较常见的一种，细胞受支原体污染程度较轻时，不会表现出明显的症状，但一旦这种潜伏的污染爆发时，细胞会大量脱落，细胞培养液会变浑浊。原代细胞和传代细胞都可能遭受支原体污染，根据国外不同实验室的调查结果显示，有15%-80%的细胞被支原体污染，传代细胞的污染率高于原代细胞。

　　尽管自然界中存在的支原体有120多种，但污染细胞的支原体主要有5种，分别为牛源的莱氏无胆甾原体和精氨酸支原体，人源的口腔支原体和发酵支原体，猪源的猪鼻支原体，这5种支原体占所有支原体污染的95%以上。

　　支原体污染可能来自操作人员和细胞培养用原材料如血清和胰蛋白酶，也可能来自于本身已被污染的细胞系和毒种。细胞受支原体污染后，功能和活性都会受到影响，会带来不可靠的实验结果和不安全的细胞制品，因此对细胞进行支原体检测十分关键。

　　支原体检测相关法规概览

　　支原体检测属于监管要求的一部分，支原体检测方法在全球范围内的一些药典、法规和指导文件中均有说明。传统的培养方法和指示细胞培养方法并非完全一致，可能会因不同监管管辖区而有所不同。

　　针对生物制药产品支原体检测的检测指导方针包括以下内容：

　　•中国药典2020版三部：生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制

　　•中国药典2020版三部：3301支原体检查法

　　•欧洲药典2.6.7：Mycoplasmas

　　•美国药典<63>：MycoplasmaTests

　　•ICHQ5D:用于生产生物技术/生物产品的细胞底物的起源和特征描述

　　•CBER/FDA,Pointstoconsiderinthecharacterizationofcelllinesusedtoproducebiologicals（用于生产生物制品的细胞系检定的考虑要点）(1993)

　　•CBER/FDA,Pointstoconsiderinthemanufacturingandtestingofmonoclonalantibodyproductsforhumanuse（在生产和检测人用单克隆抗体产品时的考虑要点）(1997)

　　•FDA,GuidanceforIndustry:CharacterizationandQualificationofCellSubstratesandOtherBiologicalMaterialsUsedintheProductionofViralVaccinesforInfectiousDiseaseIndications（用于生产传染病适应症病毒疫苗的细胞基质和其他生物材料的检定和验证）（2010年2月）

　　必须证明用于生物制品生产的细胞基质不含外源因子，包括支原体。支原体污染检测必须在产品开发的各个阶段进行，包括原材料、细胞库(MCB+WCB+EOPC)、病毒种子库、未加工的收获液材料和*终产品。

　　据报道，螺原体在许多昆虫物种中是传染源，昆虫细胞系也被报道在哺乳动物中引起致病作用，建议对昆虫细胞或暴露于植物源性材料的细胞进行螺原体检测。还建议对接触过植物或昆虫材料的生物制药产品进行螺旋体检测。

　　哪些样品需要进行支原体检测？

　　•生物源性材料：如猪胰酶、牛血清等（如作为生物制品生产用原材料）

　　•生产及检定用细胞库：MCBWCBEOPC

　　•抗体上清收获液UPB

　　•病毒类疫苗的病毒收获液、原液

　　•临床治疗用细胞

　　•其他可能受支原体污染的材料、样品等

　　支原体检测方法

　　转换支原体检测方法既昂贵又耗时，因此在**时间选择*佳方法有助于避免产品开发、制造和放行的延误。

　　美国药典＜USP＞63中指出需要用两种方法检测支原体污染：（A）琼脂－肉汤培养法（B）指示细胞法。并提到经验证的核酸扩增方法（NAT）或酶学方法可以用于检测支原体，但前提是该方法经验证可与培养法和指示细胞法等效。

　　欧洲药典EP2.6.7中也要求培养法和指示细胞法同时检测，并且更详细的介绍了NAT方法代替前1或2种方法的具体验证要求。直接NAT法可以在有细胞毒性的材料中应用或需要快速方法时使用。细胞培养富集后NAT方法适合于待检样品与指示细胞共培养一段时间后，从细胞和上清中提取核酸，再通过NAT检测。

　　中国药典3301指出主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体；必要时，亦可釆用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。

　　方法适用性

　　生长抑制性物质检测

　　欧洲药典和美国药典中都提出了检测支原体前需要对待检样品中的对支原体生长起到抑制性的物质（InhibitorySubstances）进行判断，即方法适用性验证。如果产品/样品的生产方法存在变更可能影响支原体的检测需要重新对样品对支原体抑制性进行检测。

　　1.培养法

　　•检测样本直接接种到琼脂平板以及液体培养基中。

　　•所选择的琼脂和液体培养基具有令人满意的营养特性，可支持多种支原体的生长。

　　•每个支原体检测分析中都包含阴性和阳性对照，以检查系统适用性。

　　•在培养期间，液体培养物在多个时间点被传代培养到琼脂平板上，以观察支原体的生长。

　　•在培养期结束时，用显微镜检查琼脂平板上是否存在支原体菌落。

　　•总检测时间为28天。

　　2.指示细胞法

　　有些挑剔的支原体菌株被称为“不可培养”，因为它们不能在用于培养方法的标准培养基中生长。Vero或NIH3T3细胞的培养物用于培养支原体。孵育一周后，将细胞固定，用DNA结合荧光染料染色，并在显微镜下进行评估。

　　在支原体感染的情况下，当污染严重时，细胞表面和周围区域会出现明亮荧光的特征模式。

　　3.qPCR方法

　　•特异性核酸扩增及荧光探针技术：这种支原体检测分析检测特定核酸序列的存在，但不一定表明存在活支原体。

　　•肉汤培养基生长富集和RT-PCR：这种测定包括核酸检测前的生长富集步骤，以从非活菌和残留环境源中区分活菌。样本在第0天和第7天进行检测。

　　•细胞共培养生长富集和RT-PCR：这种支原体检测方法包括核酸检测前的生长富集步骤，以从非活菌和残留环境源中区分活菌。样本在第0天和第5天从细胞共培养中进行检测。

　　•螺原体检测：这种测定包括核酸检测前的生长富集步骤，以从非活菌和残留环境源中区分活菌。样本在第0天和第7天进行检测。

　　尽管PCR检测更常用于支原体检测，但监管机构并未普遍批准基于PCR的支原体检测。可以使用PCR作为过程控制和产品特定验证的补充方法；但是，需要对传统方法进行可比性研究，以证明这些方法是等效的。PCR法检测时间相对较短、广谱性强。虽然PCR法检测快速灵敏，但是，也有一些研究指出，PCR方法也存在可能的问题：（1）支原体的特异性引物与衣原体具有同源性，会使PCR检测结果出现假阳性。（2）细胞培养几天后，培养液中会产生严重抑制PCR扩增的代谢物，所以样品前处理是PCR法不可或缺的一个环节。（3）灵敏度有限，通常需要将培养液离心浓缩或者提取DNA后检测。