1.范围
本标准规定了食品中产气荚膜梭菌( Clostridium perfringens)的检验方法。
本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。
2.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
a) 恒温培养箱:36℃±1℃;
b) 冰箱:2℃～5℃;
c) 恒温水浴箱:50℃±1℃,46℃±0.5℃;
d) 天平:感量0.1g；
e) 均质器;
f) 显微镜:10×～100×;
g) 无菌吸管:1mL(具0.0lmL刻度)、10mL(具0.lmL刻度)或微量移液器及吸头;
h) 无菌试管:18mmx180mm;
i) 无菌培养皿:直径90mm；
j) pH计或pH比色管或精密pH试纸；
k) 厌氧培养装置。
3.培养基和试剂
3.1 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂:见附录A中A.1。
3.2 液体硫乙醇酸盐培养基(FTG):见附录A中A.2。
3.3 缓冲动力-硝酸盐培养基:见附录A中A.3。
3.4 乳糖-明胶培养基:见附录A中A4。
3.5 含铁牛乳培养基:见附录A中A5。
3.6 0.1%蛋白胨水:见附录A中A.6。
3.7 革兰氏染色液:见附录A中A.7。
3.8 硝酸盐还原试剂:见附录A中A8。
3.9 缓冲甘油-氯化钠溶液:见附录A中A.9。
4.检验程序
产气荚膜梭菌检验程序见图1。
5.操作步骤
5.1 样品制备
5.1.1 样品采集后应尽快检验,若不能及时检验,可在2℃～5℃保存;如8h内不能进行检验,应以无菌操作称取25g(mL)样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体样品应加双料),并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。
5.1.2 以无菌操作称取25g(mL)样品放入含有225mL0.1%蛋白胨水(如为51.1中冷冻保存样品,室温解冻后,加入200mL0.1%蛋白胨水)的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1min～2min;或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均质杯中,8000r/min～10000rmin均质1min～2min,作为1:10稀释液。
5.1.3 以上述1:10稀释液按1mL加0.1%蛋白胨水9mL制备10-2～10-6的系列稀释液。
5.2 培养
5.2.1 吸取各稀释液1mL加入无菌平皿内,每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50℃的TSC琼脂(可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温)15mL,缓慢旋转平皿,使稀释液和琼脂充分混匀。
5.2.2 上述琼脂平板凝固后,再加10mL冷却至50℃的TSC琼脂(可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温)均匀覆盖平板表层。
5.2.3 待琼脂凝固后,正置于厌氧培养装置内,36℃±1℃培养20h～24h。
5.2.4 典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。
5.3 确证试验
5.3.1 从单个平板上任选5个(小于5个全选)黑色菌落,分别接种到FTG培养基,36℃±1℃培养18h～24h
5.3.2 用上述培养液涂片,革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌,有时可见芽孢体。如果培养液不纯,应划线接种TSC琼脂平板进行分纯,36℃±1℃厌氧培养20h～24h挑取单个典型黑色菌落接种到FTG培养基,36℃±1℃培养18h～24h,用于后续的确证试验。
5.3.3 取生长旺盛的FTG培养液1mL接种于含铁牛乳培养基,在46℃±0.5℃水浴中培养2h后,每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象,该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质,通常会上升到培养基表面。5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖,凝固酪蛋白并大量产气,呈“暴烈发酵”现象,但培养基不变黑。
5.3.4 用接种环(针)取FrG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基,于36℃±1℃培养24h。在透射光下检査细菌沿穿刺线的生长情况,判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长,无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5mL试剂甲和0.2mL试剂乙以检査亚硝酸盐的存在。15min内出现红色者,表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐;如果不岀现颜色变化,则加少许锌粉,放置10min,出现红色者,表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力,能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
5.3.5 用接种环(针)取FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基,于36℃±1℃培养24h,观察结果如发现产气和培养基由红变黄,表眀乳糖被发酵并产酸。将试管于5℃左右放置1h,检査明胶液化情况。
如果培养基是固态,于36℃±1℃再培养24h,重复检査明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖,使明胶液化。
6.结果与报告
6.1 典型菌落计数
选取典型菌落数在20CFU～200CFU之间的平板,计数典型菌落数。如果:
a) 只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU～200CFU之间,计数该稀释度平板上的典型菌落;
b) *低稀释度平板的典型菌落数均小于20CFU,计薮该稀释度平板上的典型菌落;
c) 某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;
d) 某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU,且下一稀释度平板上有典型菌落,但其平板上的典型菌落数不在20CFU～200CFU之间,应计数该稀释度平板上的典型菌落
e) 2个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU～200CFU之间,分别计数2个稀释度平板上的典型菌落。
6.2 结果计算
6.1 计数结果按公式(1)计算:
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