详解医疗器械体外细胞毒性检测

什么是

体外细胞毒性试验？

体外细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境，检测医疗器械及生物材料接触机体组织后所发生的细胞溶解、抑制细胞生长和其他毒性作用的体外试验。体外细胞毒性试验是医疗器械生物学评价体系中*重要的检测指标之一，几乎也是医疗器械及生物材料临床应用前的必选项目。

哪些产品需要进行体外细胞毒性试验？

与人体接触或植入体内的医疗器械都需要进行细胞毒性试验。与人体接触的部位包括：

1）表面：皮肤，粘膜，损伤表面。

2）外部接入：组织/骨/牙，循环血液。

3）体内植入：组织/骨，血液。

体外细胞毒性试验的目的和意义

目的：评级医疗器械和生物材料致细胞毒性反应的潜在性，并预测*终生物体应用时的组织细胞反应。通过体外细胞培养技术，可检测供试品接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、细胞溶解、死亡或其他毒性反应。

意义：可在短时间内较经济、简便地筛选出批量供试品的细胞毒性，它为动物试验的进行与否提供了先决条件，对新型医疗器械及生物材料的研制和应用提供了重要保证。

体外细胞毒性试验依据的相关标准

ISO 10993-5:2009 Biological Evaluation of Medical Devices -Part 5: Tests for in vitro Cytotoxicity

GB/T16886.5-2007医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验，GB/T16886是由ISO 10993转化过来的标准

GB/T 16175-2008  医用有机硅材料生物学评价试验方法

GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物试验方法

YY/T0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价 第2单元 试验方法 细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法  

细胞系和培养基的选择

优先采用已建立的细胞系并从认可的贮源获取。试验只能使用无支原体污染细胞，使用前应该检测原代培养细胞是否存在支原体。推荐使用小鼠成纤维细胞或人上皮细胞，如果能证明试验的重现性和精确性，也可选择其他细胞系。使用冻存细胞时，如果有二甲亚砜或甘油等细胞保护剂，应该除去保护剂，使用前至少传代培养一次。传代培养细胞时，采用适合细胞系的酶分散法或机械分散法移出和重悬细胞。

培养基应无菌，含血清或无血清培养基应该符合选定细胞系的生长要求，培养基中可以含有对试验无不良作用的抗生素，pH值应该保持在7.2~7.4之间，且培养基的贮存条件应该经过验证才能在此条件下进行保存。

体外细胞毒性试验原则

体外细胞试验方法较多，且各有其特点，各试验方法之间很难达到完全一致，因此在选择试验方法时，需根据“*接近应用状况”的原则，尽可能合理地选择供试品与细胞的接触方式和检测生物终点评价方法。

体外细胞毒性试验方法

体外细胞毒性试验具有通用性，可以适用于各种医疗器械和生物材料的评价，GB/T16886.5标准不是规定一个单一的试验方法，而是规定一个试验方案，需要在一系列试验步骤中判断，以选出*合适的试验，试验主要分三类：浸提液试验，直接接触试验和间接接触试验（琼脂扩散试验和滤膜扩散试验）。

由于医疗器械产品和材料的多样性，植入机体环境中的变异性，与机体相互作用的复杂性等因素，选择哪种方法进行体外细胞毒性评价，不同的试验人员会有不同的选择。当一个评价项目具有多个试验方法时，应考虑试验的原理、灵敏性、可选性、可定量性、重现性、试验材料的适用性及局限性等因素进行选择。例如浸提液法适合检测溶出物的毒性；直接接触法对材料的细胞毒性敏感性*高，可检测出材料微弱的细胞毒性，间接接触法中的琼脂扩散试验适合于毒性大的大批量材料筛选，滤膜扩散法适合于小分子量毒性材料的评价。以上各种方法因原理不同，各有特点，应根据试验材料本身理化性质、毒性作用强弱及其用途，正确地选择试验方法。

浸提液试验-MTT法，XTT法和WST-8法比较

MTT（二苯基四氮唑）法，又称MTT比色法，检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法有灵敏度高、较经济的优点。

XTT（二甲氧唑黄）是类似MTT的化合物，XTT法检测原理与MTT法相同。在电子耦合试剂存在的情况下，活细胞线粒体中存在与辅酶Ⅱ相关的脱氢酶，可将黄色的XTT还原成水溶性的橘黄色的甲瓒，生成的甲瓒能够溶解在组织培养基中，不形成颗粒，可直接用酶标仪测定吸光值。

WST-8（四唑单钠盐）属于MTT的升级产品，检测原理是在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲瓒产物。产物颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。该方法简便、准确、灵敏度高，但是价格比MTT法略高。

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