发光细菌法水质急性毒性检测方法

发光细菌法适用于水质、工业废水、纳污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质等急性毒性检测。发光细菌法测定是一种简便快速的生物毒性检测方法,它不仅能测试理化法所能测定的单因子指标,尤其能快速准确的测试出环境的综合毒性指标,具有理化法和传统生物监测法无可比拟特点。

1、方法提要

基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关伊< 0.05)，因而可通过生物发光光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性毒性水平。

水质急性毒性水平按8所述条件选用相当的参比毒物氯化汞浓度(以mg/L为单位)来表征，或选用ECSO值(半数有效浓度一一以样品液百分浓度为单位)来表征。

2、发光细菌法简介

2.1 发光细菌法的原理

发光细菌是一类非致病的革兰氏阴性兼性厌氧细菌, *适温度20～ 30℃, pH6～ 9.N aCl 浓度3% , 在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌, 这种可见荧光波长在450～490nm 之间, 在黑暗处肉眼可见. 发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。毒物的毒性可以用EC50表示, 即发光细菌发光强度降低50%时毒物的浓度。发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP 等发光要素,在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高, 处于积*分裂状态时,其ATP含量高, 发光强度增强。发光细菌在毒物作用下, 细胞活性下降,ATP含量水平下降, 导致发光细菌发光强度的降低。实验显示, 毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系, 因而, 可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小, 用发光度表征毒物所在环境的急性毒性.这种方法是20世纪70年代后期提出的一种微生物监测新方法, 因其灵敏、快速、简便、费用低廉则独具特色.

2.2  发光细菌法测定方法

(1)  新鲜发光细菌培养物测定法

将发光细菌接种于液体发光培养基中, 在适当条件下(约20℃) 通气培养12小时(对数生长期),用缓冲液稀释至适当的菌浓度后加入测试管中与试液混合10-20分钟,读出样品管和对照管的光强度.

(2)  发光细菌和藻类混合测定法

有些有毒物对发光细菌无直接的毒害作用,而对藻类有毒害作用,利用这一特性,把培养好的发光菌悬液和藻类悬液混合后加入测试管中与试液混合,经光照一段时间后测定发光菌的光强度变化.由于毒物对藻类的毒害而干扰藻类的光合作用,使之放氧能力下降,发光菌因缺氧其放光能力也随机下降,因此可以根据光合作用放氧多少而导致发光菌发光强度的变化来推算出毒物毒性的大小.

(3)  发光细菌冷冻干燥制剂测定法

将培养到对数生长期的发光细菌采用特殊方法制成干燥粉剂保藏于冰箱中, 使用时取出加入缓冲液保温平衡5-10分钟,使其恢复到原来的生理状态和发光水平,然后用于测试.其特点是每次使用的发光菌具有相同的生理状态,对毒物灵敏性一致,易于定量测定,结果重复性,可比性好,操作简便,可长期保藏,这将是该技术发展的方