多功能酶标仪成像功能检测手册

　　多功能酶标仪指拥有多种检测模式的单体台式酶标仪。通常某些多用途高端型酶标仪支持标准1cm比色皿检测，不仅仅微孔板可进行吸光度(Abs)、荧光强度(FI)、时间分辨荧光(TRF)、荧光偏振(FP)、和化学发光(Lum)检测，并且从以上技术中衍生出多种检测方法，主要包括时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)、AlphaScreen/AlphaLISA及BRET，另外1cm比色皿也可进行除吸光度检测外的荧光强度和化学发光检测。
　　传统酶标仪只能通过读取光强度值这种单一数据来测定被检测物浓度，无法给出更多信息，在细胞检测中则会因为细胞分布不均或数量太少而影响结果准确性。为了满足细胞类检测对数据的更高要求，如细胞数量、生长融合度、细胞形态和增殖、凋亡水平等，具有成像功能的多功能酶标仪应运而生，让酶标仪也能“看的见、看的清”，不仅大大丰富了传统酶标仪的数据输出种类，同时也提升了结果的可靠性，扩展了研究人员的工作能力，使之成为生物学和药筛领域的得力工具之一。
　　酶标仪读数反映一个区域的光信号强度，但不关心这个区域中信号的分布和信号是来自背景或阳性染色，而成像则可以“看到”具体对象，从而提取出更确切的信息。
　　普通酶标仪每个孔只有一种数据，但是具有成像功能的酶标仪还可以获得样品计数、样品面积、样品平均荧光强度、样品总荧光强度、孔覆盖率和感兴趣蛋白表达量等种类更加丰富的数据。因此，具有成像功能的酶标仪的诞生填补了普通酶标仪与高内涵成像系统之间的空白，是一座架起酶标仪和高内涵成像系统之间的桥梁。
　　成像功能硬件特点
　　成像硬件部分采用LED灯作为光源，CCD作为检测器，具有激光自动聚焦功能，其亮点在于光源并非采用传统的垂直照射多孔板的方式，而是很有创意的采用了斜照明方式，照射角度小于90度，这样避免了垂直照射时反射光也会垂直反射到荧光光路从而对荧光信号检测造成强烈干扰的缺点，这种特殊的光路设计可使反射光从另一个方向反射出去，获得的荧光信号有更高的信噪比，且大大提升了对弱荧光的检测灵敏度。
　　酶标仪成像功能的应用
　　1、透射光通道下的无标记细胞识别和计数
　　基于细胞成像的分析技术一般需要使用荧光染料进行标记，一些荧光标记可能对活细胞具有毒性或者只能用于固定过的细胞进行染色。无标记细胞分析技术使得研究者既无需耗时耗力的染色流程也无需担心染料对正常细胞活力的影响，就可以计算出细胞数目和细胞汇合度，**时间获得量化的细胞增殖及健康情况的数据。
　　无标记细胞分析技术进行细胞计数：将 CHO 细胞按照 8000/孔至 250/孔的密度铺在 384 孔板中并培养过夜。第二天，使用细胞成像系统的透射光 (TL) 通道进行成像。为了更好的比较无标记细胞计数和荧光标记细胞计数两种方法的效果，相同细胞被固定后用绿色全细胞染料或红色核染料进行染色，然后使用相应的荧光通道 ( 541 nm 和713 nm )进行成像。
　　无标记分析技术使用的是透射光通道成像后对细胞数目进行计算。
　　总结：无标记分析技术作为一种可进行细胞计数和监测细胞生长状态的新方法，可大大节约了试验的时间和昂贵的染料。无需固定细胞和染色意味着生长中的活细胞也能在任何时间被分析检测，并且不干扰细胞之后的正常生长，方便进行后续分析检测。
　　2、DAPI染色替代方案：活细胞成像计数
　　DAPI是一种常用于多种成像实验，如荧光显微成像，染色体扩散，FACS和一些细胞检测中细胞核DNA的染色标记。然而，检测过程中UV的激发会诱发DAPI光转化并影响FITC/GFP通道的检测，导致错误的结果解析。而且，为了获得*佳的染色结果，DAPI染色还需要进行细胞固定。针对这些不足，本次应用提供了一些DAPI 染色的替代方案，包括完全无需细胞染色的，可以用于活细胞染色的无标记技术。
　　对于细胞计数，StainFree技术和活细胞红色染料可以达到和DAPI细胞计数一样的效果, 但是D A P I 需要在染色之前固定。StainFree的优势就是*大程度保留细胞活力，并且尽可能减少操作时间，因为StainFree既不涉及荧光染料，也不涉及固定。对于需要核染的情况，如监测核大小或着色水平，活细胞红色染料可用于替代DAPI，但不需要固定。它跟DAPI一样也不会干扰绿色荧光成像，而DAPI已经被证明过了。StainFree技术或活细胞红色染料更适用于基于活细胞的实验，并且能够更好地证明实验结果。
　　3、无标记细胞增殖和形态评价
　　越来越多的化合物因为人类活动而被释放到环境当中，有许多对野生生物和人类具有潜在的长期负面影响。在20世纪，有几千种化合物被注册到欧盟市场，在这些化合物的生产和使用中有一些被释放到了环境当中。近些年，大家都致力于在化合物毒性方面开发新的方法以快速筛选各种化合物。在体外毒性测试中，经常会用终点法检测对细胞增殖的抑制，但也会有两大局限：
　　（1）一些毒性实验如MTT，是基于特异酶的活性，而一些化合物会影响酶活却并不产生细胞毒性；
　　（2）数据种类单一，不足以提供更多证明化合物有害的指标。
　　高内涵筛选(HCS)是目前*新的全自动成像和定量分析方式，提高数据输出的通量及种类，是目前发现新化合物和评价其作用更为有效的手段。
　　4、荧光蛋白表达
　　GFP的转染优化
　　荧光蛋白表达，例如绿色荧光蛋白(GFP)，其读数通常用于报告基因检测。在一个典型的报告基因检测中，报告基因连接在感兴趣的基因调控序列上，能够十分容易的对其进行检测和测量。带有GFP报告基因的感兴趣基因，其活性的增强会导致细胞中荧光蛋白表达的增加，这一过程可在荧光微孔板读板机或细胞成像计数仪上测定。实行报告基因检测的**步是转染，将DNA诱导进真核细胞中。
　　为了得到*佳效果，转染过程必须**通过测试不同转染条件来进行优化。优化过程可能涉及尝试不同的转染试剂，不同的DNA转染量和不同的DNA与转染试剂用量比例。细胞密度同样重要，所以*好可以测试不同细胞密度下的转染。不同转染条件下的相对效果可以在荧光微孔板读板机或细胞成像计数仪上进行监测。
　　5、细胞活性/凋亡/毒性检测
　　细胞活性、凋亡和毒性检测通常用于以下几个方面：
　　（1）细胞生物学基础研究，涉及各种水平的调控、表达、信号传递与细胞活性的关系等；
　　（2）疾病机制及治疗药物研究，例如检测抗肿瘤药物对肿瘤细胞生长的效用；
　　（3）药物毒理和安全评价，例如药物对细胞毒性的剂量测定；
　　（4）环境毒理学，例如环境污染物对细胞生长的毒害检测；
　　（5）食品农业方向，例如检测食品中农药残留对细胞活性的影响。
　　常规的检测方法有以下几种：
　　（1）根据活细胞中的酶活性，如MTT、XTT、WST-1、CCK8的显色反应；
　　（2）根据活细胞中的ATP含量，如ATP含量越高，luciferase萤光素酶与底物反应越强，发光越强；
　　（3）根据活细胞膜的完整性/通透性，如活细胞的完整细胞膜可以阻挡荧光染料分子的渗透，死细胞的细胞膜通透性增强而可被渗透，一些DNA染料即可分别标记活细胞与死细胞。