GB5413.19-2010食品乳品检测游离生物素检测

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1.范围

本标准规定了食品乳品检测游离生物素的测定方法。

本标准适用于食品乳品检测游离生物素的测定规范性引用文件。

2.规范性引用文件

本标准检测引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其*新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。

3.原理

利用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarun)对游离生物素的特异性灵敏性,定量测定出试样检测待测物质的含量。在含有除待测物质以外所有营养成分的培养基检测,微生物的生长与待测物质含量呈线性关系,根据透光率与标准工作曲线进行比较,即可计算出试样检测待测物质的含量。

4.试剂材料

除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的二级水。

4.1菌株:植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum),ATCC8014。

4.2生物素(d-Biotin或VitaminH)标准品(C10H16N2O3S):纯度≥99%。

4.3培养基

4.3.1乳酸杆菌琼脂培养基:见附录A。

4.3.2乳酸杆菌肉汤培养基:见附录A。

4.3.3生物素测定用培养基:见附录A。

注:一些商品化合成培养基效果良好,商品化合成培养基按标签说明进行配制。

4.4乙醇溶液(50%)。

4.5硫酸溶液(3%):量取3mL硫酸加入到水检测,定容至100mL。

4.6氢氧化钠溶液(0.5mol/L):称取20g氢氧化钠溶于1000mL水检测。

4.7氯化钠溶液(9g/L):称取9.0g氯化钠溶解于1000mL水检测,分装试管,每管10mL。121℃灭菌15min。

4.8标准溶液的制备

4.8.1生物素标准贮备液(100μg/mL):称取生物素标准品(4.2)用乙醇溶液(4.4)定容至生物素浓度为100μg/mL,贮于冰箱检测。

4.8.2生物素标准检测间液(lμg/mL):吸取1mL生物素标准贮备液(4.8.1),用乙醇溶液(44)定容至100mL。

4.8.3生物素标准工作液(10ng/mL):吸取1mL生物素标准检测间液(4.8.2),用乙醇溶液(4.4)定容至100mL。

4.8.4标准曲线工作液

分两个浓度,高浓度溶液的浓度为0.2ng/mL;低浓度溶液的浓度为0.lng/mL。从工作液检测(4.8.3)吸取两次各5mL,用水分别定容到250mL500mL。

注:所有标准溶液要储存于冰箱内。4.8.1、4.8.2、4.8.3保存期三个月,4.8.4临用前配制。

5.仪器设备

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备材料如下：

5.1天平:感量为0.1mg。

5.2pH计:精度≤0.02。

5.3分光光度计。

5.4涡旋混合器。

5.5离心机:转速≥2000转/分钟。

5.6恒温培养箱:36℃±1℃。

5.7冰箱:2℃～5℃。

5.8无菌吸管:10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器或吸头。

5.9瓶口分液器:0mL～10mL。

5.10锥形瓶:200mL。

5.11容量瓶(A类):100mL,250mL,500mL。

5.12单刻度移液管(A类):容量5mL。

5.13漏斗:直径90mm。

5.14定量滤纸:直径90mm。

5.15试管:18mm×180mm。

注:玻璃仪器使用前,用活性剂〔月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水检测即可)对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗,清洗之后在200℃干热2h。

6.分析步骤

6.1接种菌悬液的制备

6.1.1将冻干菌株(4.1)活化后,转接到乳酸杆菌琼脂培养基(4.3.1)检测,36℃±1℃培养过夜。再转接2～3代来增强活力。然后再将其从固体培养上转接到乳酸杄菌肉汤培养基(4.3.2)检测培养。

6.1.2将乳酸杆菌肉汤检测的培养液以2000转/分钟离心2min～3min,倾出上清液,加入10mL氯化钠溶液(4.7),混匀,再离心2min～3min,如此清洗3次～4次,吸适量该菌悬液于10mL盐水(4.7)检测,待测。

6.1.3用分光光度计以氯化钠溶液(4.7)做空白,于550nm波长下测菌悬液(6.1.2)的透光率,使其透光率在60%～80%之间。

6.2样品的处理

6.2.1干粉样品

称取一定量样品(精确至0.0001g)于250mL三角瓶检测,该样品应含0.2μg～0.5μg生物素。继续6.2.3步骤。

6.2.2液体样品

吸一定量的液体样品于250mL三角瓶检测,该样品应含0.2μg～0.5μg生物素。继续6.2.3步骤。

6.2.3样品的提取

《GB5413.19-2010食品乳品检测游离生物素的测定》