HPLC-MS检测荔枝果皮中的根皮苷

检测及试验方法

　　材料和试剂

　　D101大孔树脂(天津南开和成公司)。根皮苷标准品购自美国Sigma公司，纯度≥99.0%。流动相所用甲醇为色谱纯( Dikma公司)，实验用水为去离子水。其余试剂均为分析纯。荔枝品种为桂味，采自广州增城船坑果园。

　　实验方法

　　1.标准品配制：

　　精密称取根皮苷标准品0.0050g，溶于甲醇中，配制浓度0.02 g·L-1的标准贮备液，使用时稀释成不同浓度梯度的标准使用液。标准品溶液4℃避光保存。

　　2.样品前处理:

　　新鲜荔枝果皮(连衣)阴干后，粉碎过40目筛。准确称取荔枝皮粉末10.0 g，加入70%乙醇150 mL，超声处理30 min，功率****。过滤后重复提取一次，合并滤液。滤液经旋转蒸发仪减压浓缩至70 mL，加入180 mL无水乙醇静置过夜，滤过，减压浓缩至醇全部挥发，加入纯水150 mL超声辅助溶解，抽滤，得到粗提液。

　　粗提液上样至经处理的大孔树脂柱20 mL，上样速度1 mL·min-1，然后用纯水淋洗至无色(共450mL纯水)。再用70%乙醇50mL解吸附，流速1mL·min-1，洗脱液4℃避光保存，得到荔枝皮提取液。

　　3.固相萃取:

　　取荔枝皮提取液5mL通过活化后的固相萃取小柱(活化固相萃取小柱先用10mL甲醇通过小柱，再以10mL纯水洗去甲醇，速度均为1 mL·min-1)，速度1mL·min-1，前3 mL流出液弃去，余流出液经0.45μm微孔滤膜后作高效液相色谱检测。

　　4.高效液相色谱测定条件:

　　以甲醇-0.1%乙酸为流动相进行梯度洗脱(根据本实验室之前研究结果改良)，甲醇(A) -0.1%乙酸(B，V∶V，pH=3.20)，0～20 min，45%～60% A。进样量:10μL;柱温: 40℃;检测波长286 nm。

　　5.质谱参数设定:

　　采用电喷雾电离源(ESI)，壳气流速15单位，喷雾电压3kV，毛细管电压18V，毛细管温度200℃，选择离子扫描，质量数扫描范围434.50～435.50m/z。

　　实验结果

　　1.HPLC系统适用性调试结果：

　　分别对研究分析所用HPLC系统进行调试，根皮苷标准品溶液在7.2 min位置出峰;荔枝皮样品溶液也在此位置上出现目标组分峰，参见图。处理计算后知:根皮苷保留时间tR= 7.22min。其与周围可能存在的干扰物分离良好，分离度约为1。

HPLC 图谱

    2.MS系统实用性

　　分别对研究分析所用MS系统进行调试，根皮苷标准品溶液在7.9 min位置出峰;荔枝皮样品溶液也在8.0 min位置上出现目标组分峰，参见图2。处理计算后知:根皮苷保留时间tR = 8.0 min。其与周围可能存在的干扰物分离良好。

HPLC-MS 图谱

　　3.标准曲线

　　将根皮苷标准储备液梯度稀释为0.0100、0.005、0.0025、0.00125、0.000625、0.000312 5 g·L-1标准溶液，在已确定的高效液相色谱条件下，分别将不同浓度的根皮苷标准溶液进样分析，根据峰面积与标准物质的含量关系进行线性回归，得到标准曲线为Y = 0.0275X + 0.0739，线性范围0.000312 5～0.010g·L-1，相关系数(R2)0.9992，表明线性关系良好，能满足定量分析的要求。

　　4.方法检测限和定量限

　　以信躁比S/N=3来估算检测限，根皮苷的检测限为0.302 mg·L-1，信噪比S/N =10计算出定量限为0.906 mg·L-13.

　　5.精密度、稳定性和重复性试验

　　精密吸取浓度为0.005 g·L-1的标准溶液，连续进样5次，峰面积的RSD为0.26%。

　　精密称取荔枝皮粉末10.0 g，共6份，制备供试品溶液的方法制备溶液，进样测定，计算得根皮苷含量的RSD为1.84%，表明在该色谱条件下仪器精密度良好。

　　6.加样回收率试验

　　精密称取荔枝皮粉末10.0g，共9份，分别精密加入低( 0.00125g·L-1 )、中(0.005 g·L-1 )、高(0.0100g·L-1 )浓度的标准溶液各2 mL，分别制备供试品溶液的方法制备溶液，进样测定，计算得平均回收率为99.0%，RSD为1.26%(n=9)。

　　7.若干实际样品测试检测结果

　　精密称取荔枝皮粉末10.0 g，共5份，制备供试品溶液的方法制备溶液，进样测定，每个样品重复进样3次，按标准曲线计算含量，分别为0.001 901、0.001 773、0.001 886、0.001 616和0.001762 g·L-1,平均含量0.001788g·L-1。