食品添加剂 维生素D2（麦角钙化醇）检测

1 安全提示

本标准试验方法中使用的部分试剂具有毒性或腐蚀性，按相关规定操作，使用时需小心谨慎。若溅到皮肤上应立即用水冲洗,严重者应立即治疗。在使用挥发性酸时，要在通风橱中进行。

2 一般规定

本标准所用试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682—2008中规定的三级水。

试验方法中所用杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T602、GB/T603之规定制备。

3 鉴别试验

3.1 醋酐浓硫酸呈色试验

3.1.1 试剂和材料

3.1.1.1 三氯甲烷。

3.1.1.2 乙酸酐。

3.1.1.3 硫酸。

3.1.2 分析步骤

取约0.5mg实验室样品，加5mL三氯甲烷溶解后，加0.3mL醋酐与0.1mL硫酸，振摇，初显黄色,渐变红色，迅即变为紫色，*后变为绿色。

3.2 红外光谱试验

采用溴化钾压片法，按照GB/T 6040进行试验，实验室样品的红外光谱应与对照的图谱一致。

4 维生素D₂的测定

4.1 方法提要

用高效液相色谱法，在选定的工作条件下，通过色谱柱使样品分离，用紫外吸收检测器检测，用外标法定量，计算样品中维生素D2的含量。

4.2 试剂和材料

4.2.1 正戊醇：色谱纯。

4.2.2 正己烷：色谱纯。

4.2.3 异辛烷：色谱纯。

4.2.4 维生素D2对照品。

4.2.5 维生素D3对照品。

4.3 仪器和设备

高效液相色谱仪(HPLC)。

4.4 色谱分析条件

推荐的色谱柱及典型色谱操作条件见表1,维生素D3系统适用性试验高效液相色谱图参见图C.1,各组分的相对保留时间参见表C.1。其他能达到同等分离程度的色谱柱和色谱条件均可使用。

表1 色谱柱和典型色谱操作条件

4.5 分析步骤

4.5.1 维生素D3对照品系统适应性试验贮备液的制备

称取约25mg维生素D3对照品，精确至0.0001g,置100mL棕色容量瓶中，加80mL异辛烷,用超声处理助溶1min,避免加热,使完全溶解，再加异辛烷至刻度，摇匀充氮密塞，避光，0℃以下保存。

4.5.2 实验室样品溶液的制备

称取约25mg实验室样品，精确至0.0001g,置100mL棕色容量瓶中，加80mL异辛烷，用超声处理助溶1min,避免加热，使完全溶解，再加异辛烷至刻度，摇匀。量取(5±0.05)mL上述溶液，置10mL棕色容量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。

4.5.3 维生素D2对照品溶液的制备

称取约25mg维生素D2对照品，精确至0.0001g,置100mL棕色容量瓶中，加80mL异辛烷,用超声处理助溶1min,避免加热，使完全溶解，再加异辛烷至刻度，量取上述溶液(5±0.05)mL,置10mL棕色容量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。

4.5.4 系统适用性试验

以硅胶为填充剂的色谱柱，正己烷-正戊醇(1000+3)为流动相，检测波长254nm,流速约为2mL/min。量取维生素D₃对照品贮备溶液5mL,置具塞玻璃容器中,充氮后密塞，置90℃水浴加热1h,取出迅速冷却，加正己烷(5±0.05)mL,摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支主波长分别为254nm和365nm的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45°，并距灯管5cm～6cm,照射5min,使溶液中含有前维生素D₃、反式维生素D₃、维生素D₃和速甾醇D₃。取此溶液注入液相色谱仪，测定维生素D₃的峰值，先后进样5次，相对标准偏差应不大于2.0%,前维生素D₃(与维生素D₃的比保留时间为0.5)与反式维生素D₃(与维生素D₃的比保留时间约为0.6)以及维生素D₃与速甾醇D₃(与维生素D₃的比保留时间约为1.1)的峰分离度均应大于1.0。

4.5.5 测定

取20uL实验室样品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，另取维生素D2对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算出供试品中维生素D2的含量。

4.6 结果计算

根据色谱图计算维生素D2的质量分数w1,数值以％表示，按公式(1)计算

式中：

m1—对照品溶液中维生素D2的进样量的数值，单位为微克(ug)；

A2—实验室样品溶液中维生素D2的峰面积的数值；

A1—对照品溶液中维生素D2的峰面积的数值；

m2—实验室样品溶液中维生素D2的进样量的数值，单位为微克(ug)。

取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定的允许**差不大于1.5%。