食品添加剂 核黄素5'-磷酸钠检测

A.9 游离核黄素和核黄素二磷酸盐的测定

A.9.1 试剂和材料

A.9.1.1 KH₂PO₄溶液：0.054mol/L。

A.9.1.2 甲醇：色谱纯。

A.9.1.3 核黄素标准品：核黄素含量不低于99.0%(质量分数)。

A.9.1.4 核黄素5'-磷酸钠标准品：核黄素含量不低于74.0%(质量分数)。

A.9.2 仪器和设备

高效液相色谱仪，配荧光检测器(激发波长440nm；发射波长470nm)。

A.9.3 参考色谱条件

A.9.3.1 色谱柱：C₁₈柱，3.9mm×300mm,或其他等效的色谱柱。

A.9.3.2 流动相：按K₂PO₄溶液：甲醇=85:15(体积比)配制，混合均匀后，用0.45um滤膜过滤，超声脱气后备用。

A.9.3.3 柱温：室温。

A.9.3.4 流动相流速：2.0mL/min。

A.9.3.5 进样量：100uL。

A.9.4 分析步骤

A.9.4.1 系统适应性溶液的制备

溶解100mg核黄素5'-磷酸钠标准品于水中，使其质量浓度为2.0mg/mL,加入等体积的流动相，混匀。吸取8mL,用流动相稀释至50mL,混匀备用。

A.9.4.2 标准溶液的制备

精确称取60.0mg核黄素标准品于250mL容量瓶中，小心加入1mL盐酸溶解，用水稀释至刻度，混匀。用移液管吸取4mL的核黄素溶液于100mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混匀备用。

A.9.4.3 样品溶液的制备

精确称取100.0mg样品于100mL容量瓶中，加50mL水溶解，用流动相稀释至刻度，混匀。用移液管吸取8mL溶液于50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀备用。

A.9.4.4 系统适应性要求

取适量系统适应性溶液注入色谱仪中进行色谱分析。核黄素4'-单磷酸盐和核黄素5'-单磷酸盐之间的分离度应不低于1.0；核黄素5'-单磷酸盐两次重复进样的相对标准偏差不大于1.5%。

核黄素5'-单磷酸盐的保留时间约为20min～25min。各组分的近似相对保留时间如表A.1所示。

表A.1 各组分的近似相对保留时间

A.9.4.5 测定

分别将等体积(约100uL)的标准溶液、样品溶液和系统适应性溶液注入色谱仪中进行色谱分析，记录色谱图，分别测量标准溶液和样品溶液色谱图中的峰响应值。通过比对系统适应性溶液色谱图中色谱峰的保留时间，确定样品溶液色谱图中待测的峰。

A.9.5 结果计算

游离核黄素含量以游离核黄素的质量分数W3计，数值以％表示，按公式(A.5)计算：

式中：

625—样品的稀释倍数；

Ws—标准溶液中核黄素浓度的数值，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

PF―样品溶液色谱图中核黄素的峰响应值；

PS—标准溶液色谱图中核黄素的峰响应值；

核黄素二磷酸盐含量以核黄素二磷酸盐的质量分数W4计，数值以％表示，按公式(A.6)计算：

式中：

625—样品的稀释倍数；

WS—标准溶液中核黄素浓度的数值，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

PS—标准溶液色谱图中核黄素的峰响应值；

PD—样品溶液色谱图中三种核黄素二磷酸盐峰的总响应值。

实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的**差值与算术平均值的比值不大于1.5%。